Как установить fastqc linux

Русские Блоги

После распаковки программного пакета fastqc запуск fastqc сообщает об ошибке: Нет такой команды?

Недавно я делаю CHIP-seq. После получения исходных данных из NCBI я хочу использовать fastqc, чтобы проверить, есть ли какие-либо проблемы с данными секвенирования второго поколения.
Итак, я загрузил программный пакет fastqc с официального сайта и распаковал его в папку Biosofts.
, затем запустите

Обнаружил ошибку, такой команды нет
Я думал, что это потому, что я не настраивал эту переменную среды, но после того, как я ее настроил, я все равно сообщил об ошибке
Причина поиска в Интернете заключается в том, что, хотя в распакованной папке FastQC есть файл fastqc, код ls -lh обнаружил, что у этого файла нет разрешения на выполнение. Решение заключается в следующем.
Запустите следующий код в каталоге, где находится файл fastqc.

Беги снова, чтобы бежать
Еще одно напоминание
Ubuntu поставляется с Fastqc, поэтому вы можете использовать apt install fastqc для установки fastqc
но
Fastqc, установленный с помощью apt install, работает в Linux с ошибками! ! !
Трижды скажите важное
Fastqc, установленный с помощью apt install, работает в Linux с ошибками! ! !
Fastqc, установленный с помощью apt install, работает в Linux с ошибками! ! !
Fastqc, установленный с помощью apt install, работает в Linux с ошибками! ! !
Возможна следующая ситуация.

Поэтому лучше всего загрузить пакет программного обеспечения с официального сайта и разархивировать его, прежде чем изменять права доступа к файлам!

Интеллектуальная рекомендация

Пошаговая загрузка файла Spring MVC-09 (на основе файла загрузки клиента Servlet3.0 + Html5)

пример тестовое задание Исходный код Несмотря на загрузку файлов в Servlet3.0 +, мы можем очень легко программировать на стороне сервера, но пользовательский интерфейс не очень дружелюбен. Одна HTML-ф.

Создайте многоканальное окно в приложениях Win32

Создайте многоканальное окно в приложениях Win32, создайте несколько оконных объектов одного и того же класса Windows, а окна объектов разных классов окон. .

Путь к рефакторингу IOS-APP (3) Введение в модульное тестирование

IOS-APP реконструкция дороги (1) структура сетевых запросов IOS-APP реконструкция дороги (два) Модельный дизайн При рефакторинге нам нужна форма, позволяющая вносить смелые изменения, обеспечивая при .

Tree——No.617 Merge Two Binary Trees

Problem： Given two binary trees and imagine that when you put one of them to cover the other, some nodes of the two trees are overlapped while the others are not. You need to merge them into a new bin.

Источник

Русские Блоги

Fastqc в Ubuntu, используя apt install

Fastqc в Ubuntu, используя apt install

Чтобы облегчить дюжину новичков для использования облачного сервера, у меня будет куча биологического информационного программного обеспечения, код выглядит следующим образом:

Я не ожидал первого программного обеспечения, я был неловко!

Ошибка выглядит следующим образом:

Я лицо, но легко искать причину для Google. Мастер дает объяснение в биостаре:

Поэтому я пошел в свою биологическую информацию, обычно доступную 1000 Установочный код программного обеспечения:https://www.jianshu.com/p/ae28e8e3e9f5 Найдено программное обеспечение FastQC Software Скачать метод установки:

Это позволяет вам использовать полный путь.

Однако я оставил проблему. Я установил это программное обеспечение как администратор, который оставил переменную среды всего сервера. Это необходимо очистить, и это также поиск.

Ubuntu APT-Get полностью удалить пакет

Посмотреть учебное пособие, получить:

Но нам нужно только бежать sudo apt-get —purge remove fastqc

Не нужно бегать sudo apt-get autoremove fastqc Избегайте удаления программного обеспечения Java.

Это очищает программное обеспечение системы SastQC.

Интеллектуальная рекомендация

Пошаговая загрузка файла Spring MVC-09 (на основе файла загрузки клиента Servlet3.0 + Html5)

пример тестовое задание Исходный код Несмотря на загрузку файлов в Servlet3.0 +, мы можем очень легко программировать на стороне сервера, но пользовательский интерфейс не очень дружелюбен. Одна HTML-ф.

Создайте многоканальное окно в приложениях Win32

Создайте многоканальное окно в приложениях Win32, создайте несколько оконных объектов одного и того же класса Windows, а окна объектов разных классов окон. .

Путь к рефакторингу IOS-APP (3) Введение в модульное тестирование

IOS-APP реконструкция дороги (1) структура сетевых запросов IOS-APP реконструкция дороги (два) Модельный дизайн При рефакторинге нам нужна форма, позволяющая вносить смелые изменения, обеспечивая при .

Tree——No.617 Merge Two Binary Trees

Problem： Given two binary trees and imagine that when you put one of them to cover the other, some nodes of the two trees are overlapped while the others are not. You need to merge them into a new bin.

Источник

Как установить fastqc linux

Download Babraham Bioinformatics Projects

All Babraham Bioinformatics code is released under the GNU General public license. You should be aware that some of the downloads on this page include code from other projects which is available under different license terms.

All Babraham Bioinformatics projects are distributed WITHOUT ANY WARRANTY; without even the implied warranty of MERCHANTABILITY or FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE.

If you have any problems with any of the software you downloaded from here then please report them to us and we’ll do our best to get them sorted out.

If you want to stay up to date with changes to our existing projects, or with new software we have released then you can follow us on twitter You can also see demonstrations of our software on our YouTube channel 1

ASAP Performing allele-specific alignments in Next-Gen Sequencing samples with mixed genetic background

Bareback A tool to shuffle low complexity sequence to the end of Illumina sequencing runs

Bismark A bisulfite read mapper and methylation caller

• Release Notes
• Bismark User Guide v0.21.0
• Bismark test dataset
• Bismark v0.22.3.tar.gz (includes bismark2summary, deduplicate_bismark, bismark2bedGraph, coverage2cytosine and other source code)
• RRBS Guide (PDF, last updated 25 Jan 2017)

ChIPMonk ChIP-on-Chip analysis tool

• README
• Release Notes Please read these if you are upgrading from an older version!!
• ChIPMonk v1.2.3 (Win/Linux zip file)
• ChIPMonk v1.2.3 (Mac DMG image)
• Source Code for ChIPMonk v1.2.3 (zip file)
• Example data file [85MB] (unzip before use) Original paper

Cluster Flow Command line tool for bioinformatics pipelines on a cluster

• Cluster Flow Website (documentation)
• Installation / Usage Tutorial How to set up and run Cluster Flow
• Writing Pipelines and Modules How to write your own Cluster Flow pipelines and modules
• Download Cluster Flow (GitHub releases page)

Compter Analysis and visualisation of sequence composition

Difference Tracker A particle tracker for faint moving particles

• README
• Release Notes Please read these before using the program.
• Difference Tracker v0.1 (Cross Platform jar file)
• Difference Tracker v0.1 source code

FastQC A quality control application for high throughput sequence data

• README
• Installation and setup instructions
• Release Notes Please read these before using the program.
• FastQC v0.11.9 (Win/Linux zip file)
• FastQC v0.11.9 (Mac DMG image)
• Source Code for the latest FastQC release

FastQ Screen A screening application for high througput sequence data

FocalPoint Image Viewer

FRETSaw FRET Image Viewer

HiCUP Pipeline for analysing Hi-C data

Labrador Tool for managing and automating the processing of publicly available datasets

• Documentation
• README Please read these before using the program
• Installation Walkthrough Screencast of installing Apache, PHP, MySQL and Labrador on a blank server.
• End-User Usage Tutorial Screencast showing basic usage of Labrador by end-users (not administrators)
• Administration Tutorial Screencast showing basic usage of Labrador by administrators
• Labrador Releases GitHub page

mzViewer mzData Viewer

Realyser Real Time PCR Normalisation tool

re-DOT-able Dot Plot Tool

• Release Notes Please read these before using the program.
• reDOTable v1.1 (Win/Linux zip file)
• reDOTable v1.1 (Mac DMG image)
• Source Code for re-DOT-able from GitHub

reStrainingOrder Mouse Strain/Hybrid Identification

SeqMonk Mapped Sequence Analysis Tool

• README
• INSTALL Installation instructions for the program.
• Release Notes Please read these before using the program.
• SeqMonk v1.48.0 for 64-bit Windows
• SeqMonk v1.48.0 for 64-bit Linux
• SeqMonk v1.48.0 for 64-bit Mac OSX
• Source Code for SeqMonk from GitHub
• Example SeqMonk project — so you can try SeqMonk out easily (216MB)

Sherman bisulfite-treated Read FastQ Simulator

Sierra A simple LIMS for sequencing facilities

SNPsplit Allele-specific alignment sorting for N-masked genomes

SparkSpotter ImageJ plugin to identify ‘Spark’ events

StackMeasure ImageJ Plugin to identify and measure feautres in images

Trim Galore Consistent quality and adapter trimming for RRBS or standard FastQ files

• Trim Galore User Guide v0.6.1 (Markdown)
• Trim_Galore (hosted at Github) (This includes a brief RRBS Guide; last update: 13 November 2017)

Having problems with the site? Please let us know

Источник

Как установить fastqc linux

Часть 3. Обработка файлов секвенирования от А до Я

В лабораториях обработка результатов секвенирования состоит из множества запусков специальных программ. Эти шаги организуют в виде конвейера действий (pipeline), в который на входе подаются FASTQ-файлы, а на выходе получают VCF-файл. Или таблицу, удобную для анализа человеком.

При помощи Galaxy и snpEff мы пройдем все эти шаги поэтапно, каждый раз останавливаясь и проверяя, что же мы получили.

Скорее всего, у вас уже есть готовый VCF-файл. Поэтому, если вы хотите сразу перейти к анализу генетических нарушений, то можно пропустить следующую главу о выравнивании и перейти к главе об аннотировании.

Но откуда вообще может возникнуть необходимость пройти весь путь от FASTQ до VCF-файла?

1) VCF-файла может не быть, если лаборатория не проводит постобработку данных.

2) Если вы проводили секвенирование несколько лет назад, то данные в BAM и VCF-файлах могли быть выровнены по референсному геному GRCh37/hg19, который не совместим со многими новыми базами данных.

3) В VCF-файл включаются не все варианты, некоторые отфильтровываются по тем или иным критериям. Кроме того, у лаборатории могут быть свои стандарты обработки и вывода данных, которые создадут проблемы при последующем анализе.

Важно учитывать, что эталонный геном (референсный геном) , с которым происходит сравнение ваших данных, нечасто, но уточняется. В версии эталонного генома под номером GRCh38/hg38, которая вышла в 2013 году и постепенно внедрилась, порядковый номер аллеля на хромосоме уже не советует предыдущей версии GRCh37/hg19.
Это очень важный момент для анализа!
Различные версии референсных геномов означают, что в дальнейшем нам нужно будет выбирать соответствующие версии баз данных. Иначе большая часть строк будет пропущена при аннотировании – алгоритмы просто не смогут увязать вместе позиции в геноме и базе данных.
Поэтому, если у вас есть готовый VCF-файл, и вы не хотите проходить весь путь, описанный в предыдущей главе, то нужно выяснить, какая версия генома использовалась при его создании. Для этого достаточно заглянуть в шапку VCF-файла и найти строку с номером сборки. Например, если вы увидите «assembly=hg19», то у вас старый референсный геном GRCh37/hg19. Если же вы увидите hg38, то у вас новый референсный геном GRCh38/hg38.

Выравнивание данных в Galaxy: от FASTQ к VCF-файлу

Прочитанные секвенатором Illumina последовательности ДНК обычно хранятся в нескольких (двух и более) парных FASTQ файлах, упакованных в архив (расширение fastq.gz).

Поскольку работа с FASTQ-файлами очень ресурсоемкая, к тому же требует много времени, мы воспользуемся мощной и бесплатной веб-платформой Galaxy. Вы можете прочитать эту официальную и подробную инструкцию, но в ней указаны не все шаги, а о некоторых правильных действиях приходится догадываться.

Поэтому я описал свои действия здесь и снял их на этом видео.

Рекомендую параллельно использовать текстовое описние ниже, видео и официальные инструкции.

Зарегистрируемся и подтвердим в email аккаунт на сайте Galaxy https://usegalaxy.org/

Автоматически созданный проект Unnamed history можно переименовать, например, в NGS results, через меню User -> Histories.

А затем выбрав в выпадающем списке Rename.

Загрузим наши упакованные файлы на сервер, кликнув иконку загрузки:

Дождемся пока файлы загрузятся и появятся в правой колонке подсвеченные зеленым фоном.

Прежде чем приступать к анализу, наверняка будет интересно проверить качество секвенирования, оценив данные в FASTQ файлах. Для проверки качества введите в строке поиска «fastqc». И выберите из выпадающего списка инструмент FastQC Read Quality reports.

В верхнем поле «Short read data from your current history» нужно указать на иконку выбора нескольких файлов и потом на предварительно загруженные FastQ файлы. Затем нажать «Execute».

Прежде чем приступать к анализу, наверняка будет интересно проверить качество секвенирования, оценив данные в FASTQ файлах.

Секвенирование Illumina основано на идентификации отдельных молекул ДНК. У каждой из четырех молекул будет своя длина волны. Но из-за несовершенства процесса секвенирования и ограничений оптических инструментов, считывание (т.е. базовый вызов или base calling) всегда будет иметь не точный, а вероятностный характер. По этой причине файлы FASTQ хранят вместе с каждым считанным нуклеотидом, показатель качества – вероятность ошибки.

В биоинформатике используется статистическая функция phred quality score, которая определяет, насколько вероятно, что отдельный прочитанный нуклеотид (базовый вызов) может быть неверным. Например, оценка Phred 10 соответствует одной ошибке в каждых 10 базовых вызовах или точности 90%; оценка Phred 20 соответствует одной ошибке в каждых 100 базовых вызовах, или точности 99%.

Я посмотрел разницу между примерами качественных, некачественных и моих данных. Судя по зеленому флажку, мои данные приемлемого качества – лишь небольшая часть базовых вызовов приближается к Phred 20.

Вот пример хорошего качества.

Вот пример плохого качества. Качество моих данных.

Но дальнейшие действия должны быть не произвольными, а одновременными для пар файлов.

Парными FASTQ-файлы называют потому, что чтение отрезков ДНК происходит с двух концов. Прямое и обратное прочтение сохраняются каждое в отдельном файле.

Направление прочтения должно быть указано в имени файлов. У файлов с прямым прочтением будет имя похожее на ***forvard.fastq.gz, а у файлов с обратным прочтением будет имя ***reverse.fastq.gz. Или различные направления будут обозначаться буквами R1 и R2.

Например, четыре наших файла с результатами секвенирования выглядели как в первом примере:

Важно разобраться и не путать, в каких файлах находится прямое, а в каких обратное направление прочтения.

Если есть сомнения, не допустили ли вы ошибку с выбором пары, то лучше сразу отменить задание и создать его повторно, поскольку времени на его выполнение может уйти много, а ошибку мы выявим уже при работе с VCF-файлом.

Если мое объяснения не все прояснило, посмотрите видео главы «Mapping against a pre-computed genome index» по ссылке.

Далее очистим данные при помощи инструмента Trimmomatic, обрезая так называемые «адаптеры». Это служебный ДНК, который был необходим для проведения секвенирования Illumina.

Вводим в строке Trimmomatic, выбираем в выпадающем меню «Single-end or paired-end reads?» строку «Paired-end (two separate input files)»

Выбираем первый файл прямого и первый файл обратного прочтения среди загруженных файлов. Нажимаем «Execute».

Аналогично поступаем для следующих пар.

Мы получили пары очищенных файла с префиксом Trimmomatic.

Теперь можно выровнять парные файлы по эталонному геному и получить BAM файлы, в которых все прочитанные нуклеотиды будут выстроены по порядку.

Наберем в строке поиска «BWA-MEM», затем в меню поиска выберем строку «Map with BWA-MEM – map medium and long reads (> 100 bp)». Затем в строке «Using reference genome» наберем 38 и выберем «Human (Homo sapiens) (b38): hg38». То есть выберем последнюю версию референсного генома.

Важно! Если вы знаете, что вам придется использовать старые базы данных (где указаны кода GRCh37 и hg19), тогда для совместимости вам нужна предыдущая версия. В этом случае, здесь и далее наберите hg19 и выберите «Human (Homo sapiens) (b37): hg19». Иначе лучше использовать сборку hg38.

В поле «Single or Paired-end reads» указываем «Paired».

После чего появятся два поля с текстом «Select first set of reads» и «Select second set of reads». Возле них нужно выбрать иконки сдвоенных файлов, если у вас более чем два FASTQ-файла. При этом мы выбираем не исходные, а очищенные файлы с префиксом Trimmomatic.

В первом поле (кликая по порядку возрастания номеров!) выбираем файлы прямого чтения (с обозначением forward или R1), зажимая при выборе файлов клавишу ctrl.

Затем во втором поле, тоже по порядку возрастания, выбираем файлы обратного чтения (обозначения reverse или R2). Нажимаем «Execute».

Мы получим один или несколько выровненных BAM файлов, по числу файлов архива. Их имена будут начинаться со слов «Map with BWA-MEM on data…».

Объединим BAM-файлы в один.

Наберем в строке поиска «MergeSamFiles», затем в меню поиска выберем строку «MergeSamFiles merges multiple SAM/BAM datasets into one».

Затем в поле «Select SAM/BAM dataset or dataset collection» выберем два выровненных BAM-файла «Map with BWA-MEM on data…» и выполним команду.

В итоге должен получиться третий объединенный BAM-файл, который начинается с префикса «MergeSamFiles…».

Мы выровняли наш геном по эталону. А теперь мы выявим отличия нашего генома от эталона. Процесс сравнения называется variant calling. Те прочтения, которые отличаются от эталонного генома, записывают в VCF-файл. (Аббревиатура VCF означает variant call format).

Variant call мы будем делать при помощи мощного статистического детектора «FreeBayes».

Найдем его через строку поиска.

Здесь нам нужно указать на объединенный BAM-файл «MergeSamFiles…» и выбрать референсный геном «Human (Homo sapiens): hg38» (или же hg19, если вы пользуетесь не новыми, а старыми базами данных).

На выходе мы получим довольно большой VCF-файл, который начинается с префикса FreeBayes. Для экзома он содержит несколько миллионов строк, множество из которых будут с низким числом прочтений. Как правило, это прочтения за пределами кодирующих участков гена, которые не имеют особой ценности.

Отфильтруем прочтения низкого качества при помощи инструмента SnpSift Filter. На вход к нему подаем файл FreeBayes. Здесь в поле «Filter criteria» вставим текст «( QUAL > 30 ) & ( DP > 20 )».

То есть мы отсекаем прочтения с качеством по шкале Phred менее 30. Наверное, стоит сказать, что если мы используем FreeBayes, то в фильтре QUAL нет большого смысла. Потому что каждое прочтение будет вносить свой вклад в качество, а в итоге оно будет высоким и неинформативным. Но, возможно, мы отсечем какие-то совсем некачественные варианты.

Также отсечем прочтения с покрытием менее 20 (для экзома такая глубина отсечения кажется подходящей).

Количество записей относительно исходного VCF-файла (FreeBayes) сокращается более чем в 10 раз.

VCF-файл содержит, в общем, понятные аннотации относительно гомо- или гетерозиготности варианта (0/1, 1/1). Также, сравнивая фрагмент эталонного и альтернативного варианта, можно понять какой он – SNP, индель или сложная замена. Однако, для облегчения последующего анализа, можно добавить и более понятные аннотации с помощью функции SnpSift Variant Type.

Далее аннотируем VCF-файл записями из базы dbSNP, чтобы упростить себе задачу и не делать этого на локальном компьютере.

Сначала подключим нужную базу данных, перейдя по ссылкам Shared Data > Data Libraries.

В библиотеке выберем dbSNP, затем кликнем на версию dbSNP_146_hg38.vcf.

Кликнем на вкладке to History и выберем нашу историю.

Вернемся на страницу проекта и введем в строке поиска «dbsnp», а затем выберем в меню «SnpSift Annotate SNPs from dbSnp».

Здесь в первой строке выберем файл, который начинается с префикса SnpSift Variant Type, а во второй – загруженную базу данных. Выполняем действие.

Теперь в нашем VCF-файле появились rs-записи в поле ID. Это уникальные RefSNP идентификаторы известных вариантов, о которых мы говорили выше. Также добавилось множество другой полезной информации в поле INFO.

Скачаем полученный VCF-файл (см. рисунок).

Что мы будем делать с VCF-файлом?

Конечно, Galaxy – прекрасное творение энтузиастов биоинформатики. Ее возможности огромны. Но, к сожалению, мне не удалось добиться совместимости с последними версиями баз данных Clinvar, dbNSFP, GWAS. А работать желательно с обновленными источниками. Поэтому для аннотирования VCF-файла мы спустимся с облачного сервиса на локальный компьютер.

Следующий вопрос, что же мы будем делать с VCF-файлом?

Первый этап – аннотирование VCF файла. В процессе аннотирования программа snpEff, точнее ее инструменты, автоматически добавят важную информацию. Аннотации включают описание ассоциированных заболеваний, прогноз влияния варианта на функцию гена, частоты аллелей и множество других полезных данных. Поскольку медицинские базы данных периодически дополняются, нам желательно использовать последние версии.

Второй этап – фильтрация и форматирование. На основе сделанных аннотаций, будут удалены данные, которые не влияют на функцию гена и скорее всего не имеют значения для здоровья. Результаты нужно будет сохранить в табличном виде.

Третья часть – сортировка и анализ табличных данных в Excel пои помощи инструментов интерпретации. Описанные нарушения нужно сравнить с проявлениями (фентоипом). Это самая трудоемкая, потому что «ручная» работа. Возможно, придется проверить сотни записей.

В следующих главах опробуем пройти весь этот длинный путь по порядку.

Можно сказать, что большая часть данных секвенирования избыточна, поскольку прочитанные варианты совпадают с эталонным геномом и неинтересны. Для анализа важны только различия, которые и записаны в VCF-файле.

Пропустив большую шапку, посмотрим на первые два столбика файла.

Под заголовком #CHROM идет порядковый номер одной из 23 пар хромосом, в которые упакованы нити ДНК.

Напомню, что 22 хромосомы парные (аутосомные), то есть одинаковы у мужчин и женщин. У мужчин кроме них есть непарные половые Х и Y-хромосомы. А у женщин есть две Х хромосомы, то есть, все 23 хромосомы парные. Хромосомы обозначают по порядковым номерам. Например, chr5 (5-я хромосома) или chrY (Y-хромосома).

POS – позиция прочитанной молекулы ДНК, одной из миллионов, по всей ее длине. Номера идут по возрастающей.

ID – обычно заполняется в процессе аннотирования уникальными номерами вариантов из «энциелопедии» dbSNP.

Разобравшись в предыдущей главе с аллелями, мы можем взглянуть на пятый и шестой столбики VCF файла, которые называются REF и ALT. Здесь REF – это заранее известный эталонный аллель, а ALT – найденные отличия от эталона, то есть, альтернативный аллель. Если альтернативными оказались оба гетерозиготных аллеля, то записывается их пара, разделенная запятыми.

Гетерозиготные варианты проявляются как позиции, где приблизительно половина чтений соответствует эталону, а другие показания отличаются от эталона.

0/1 – образец является гетерозиготным и содержит 1 копию каждого из аллелей – эталонного REF и альтернативного ALT

1/1 – образец является гомозиготным и отличается от эталона.

Сочетание 0/0 (гомозиготный эталонный) обычно не заносится в файл вместе с самой записью, потому что не имеет значения для анализа.

QUAL – качество. Это важный интегрированный параметр, который позволяет исключить варианты аллеля ALT, которые кажутся сомнительными. Как рассчитывается качество, я писал выше.

Аннотирование VCF-файла c программой snpEff

Аннотирование VCF-файла – ресурсоемкий процесс. Важно, чтобы на компьютере было установлено не менее 4Gb оперативной памяти (лучше 8Gb и больше). Мощный процессор, SSD диск и высокоскоростной интернет также существенно ускорят работу.

Работать придется не в Windows, а в Linux, потому что именно эту среду выбрали биоинформатики для своих проектов. Но не пугайтесь, если вы не сталкивались с Linux раньше. Мы установим не полноценный Linux, а эмулятор Cygwin, который прост в работе и должен нормально справиться с нашими задачами.

На эмуляторе мы установим snpEff. Это популярная и, на мой взгляд, лучшая программа для анализа генетических данных в свободном доступе. Хотя можно было бы работать и с другими программами, например, VEP или Annovar (но тут требуется регистрация на сервере некоммерческой организации в зоне .org).

Пользователям Linux я рекомендую параллельно смотреть эту ссылку. А для пользователей Windows предлагаю пошаговую видеоинструкцию.

Прежде всего, скачиваем и устанавливаем Cygwin в корень диска С (это важно!). Можно руководствоваться этим описанием установки.

После запуска Cygwin попросит установить логин и пароль. По имени логина будет создана папка, где будут хранится все файлы.

Заходим в Program Files, находим папку Java и копируем имя папки с версией программы.

Вставляем номер версии в строке вместо “jre1.8.0_261” (стараемся вставлять без пробелов, которые любит добавлять Word) или просто копируем мою строку, если имя вашей версии Java не отличается.

Вставим эту строку в окно терминала Linux. Сразу обращу внимание, что в Cygwin вставка «ctrl+v» по умолчанию не работает, но можно пользоваться правым кликом и меню «вставить». Нажимаем Enter для ввода.

Далее проверяем, что Java запускается, для чего вводим тестовую команду на вывод версии:

Если в результате увидим java version с номером вашей версии, значит путь задан правильно и Java работает.

Заходим в каталог установленной на диске С программы cygwin64, находим там папку home, а в ней папку с именем пользователя, которая была создана автоматически в процессе установки (в моем случае C:/cygwin64/home/Eugene). Распаковываем в нее архив snpEff_latest_core.zip. Появятся папки snpEff, clinEff и некоторые файлы, как на рисунке.

Пробуем запустить программу snpEff, вводим в командной строке

Если в результате мы увидим длинный текст, который начинается с ”SnpEff version SnpEff…”, то программа работает.

Создадим в той же папке, где находятся программы, каталог для VCF-файлов. Скопируем туда ваш VCF-файл и переименуем его в 01.vcf.

Теперь мы добавим первые 19 аннотаций (о них подробнее на английском тут).

Но прежде, чем вводить следующую команду, разберем и исправим ее при необходимости.

1) Важно правильно выбрать объем оперативной памяти, выделяемой компьютером на выполнение команд. Например, если у вашего компьютера лишь 4Gb оперативной памяти, то вместо параметра “-Xmx8g”, здесь и везде далее пишите “-Xmx4g”.

2) Сегодня параллельно используются две основные версии данных, точнее референсных генома, которые нужно четко разделять. В версии GRCh38/hg38, которая вышла в 2013 году, порядковый номер аллеля на хромосоме уже не советует предыдущей версии GRCh37/hg19. Это означает, что обязательно нужно выбирать соответствующие версии баз данных.

Чтобы выяснить, какая у вас версия, достаточно заглянуть в шапку VCF-файла. Если вы увидите в строках со словами reference или assembly «hg19», то референсный геном был GRCh37/hg19. Если же вы увидите «hg38», то референсный геном был GRCh38/hg38.

3) Важно правильно создавать структуру каталогов и прописывать пути к ним. Если вы допустите ошибку, вставите лишний пробел или длинное тире вместо знака минус, то программа выдаст ошибку.

Все, что написано ниже, относится к версии референсного генома GRCh38/hg38. Но отдельно в конце главы я продублировал команды и ссылки для версии GRCh37/hg19.

Также все, что написано ниже, относится к экзому. Вероятно, команды будут работать и с геномом, но будут пропущены некодирующие области ДНК.

Перейдем к первой команде аннотирования файла.

В папке vcf сразу появится выходной файл 02.anncanon.vcf. Но пока программа snpEff не загрузит базу данных размером более 600 Mb, его размер будет нулевым и с ним ничего происходить не будет. Сначала база будет загружаться в папку tmp программы Сygwin32. После загрузки она автоматически переместится в раздел data программы snpEff. В случае повторного обращения, база данных заново загружаться не будет, а будет сразу браться из папки data.

Интересно, что в процессе аннотирования наиболее сильно используются не ресурсы процессора, а память.

Чтобы убедиться, что файл был аннотирован, откроем в Notepad++ и сравним два варианта, пропустив всю шапку.

Добавились имя гена (OR4F5), тип варианта (synonymous_variant), степень влияния на функцию гена (LOW) и множество других аннотаций.

Чтобы сделать удобным будущий анализ в Excel, мы вывели выходной файл в каноническом структурированном виде (в строке за это отвечает установленный параметр “-canon”).

Нас очень интересует клиническая информация о наших вариантах. Чтобы ее получить, загрузим свежую версию базы данных Clinvar. Для референсного генома GRCh38/hg38 ее можно найти на сервере NCBI (известном как Pubmed), по этой ссылке.

Замечу, что иногда сервер блокирует IP определенных провайдеров, поэтому, если ссылка покажется не рабочей, включите какой-нибудь VPN (например, плагин Hotspot Shield Free VPN Proxy для Chrome).

Нас интересуют 3 файла (clinvar.vcf.gz, clinvar.vcf.gz.md5, clinvar.vcf.gz.tbi), которые нужно скачать. В каталоге snpEff сохраним эти файлы по пути: data/GRCh38/clinvar/ , для чего создадим соответствующие папки.

Теперь, если мы все сделали правильно, то можем аннотировать наш файл с Clinvar. Вводим:

Были проаннотированы варианты, о которых известна какая-нибудь клиническая информация (в моем случае, около 7% записей VCF-файла).

Добавилось связанное с вариантом потенциальное заболевание, частота аллеля в популяции из проекта 1000 Genomes, характер влияния на потенциальное заболевание и многая другая информация.

Более подробно об аннотациях можно почитать здесь.

Вероятно, вам покажутся полезными аннотации из каталога GWAS (полногеномного поиска ассоциаций). Этот каталог не поможет найти редкие менделевские заболевания, но позволит выявить генетические факторы риска и дать прогноз о предрасположенности к распространенным заболеваниям и состояниям.

Замечу, что ссылка в инструкции к snpEff не работает, но каталог (размером 101Mb) можно скачать здесь.

Переименовываем файл “gwas_catalog_v1.0-associations_e100_r2020-06-30.tsv” в “gwascatalog.txt”, затем сохраняем его по такому пути: /db/GRCh37/gwasCatalog/gwascatalog.txt (потому что именно там его будет искать snpEff, несмотря на более свежую версию референсного генома).

Выполняем еоманду в терминале Linux.

В моем случае было аннотировано 2.6% строк.

Следующая аннотация будет из базы данных dbNSFP. Она разработана для функционального прогнозирования вариантов в экзоме человека. Для большинства вариантов в кодирующей области, dbNSFP содержит десятки оценок, как на основе популяционных и филогенетических исследований (частота аллелей, консервативность участка), так и на основе моделей повреждения гена (например, MutationTester).

В инструкции к snpEff для референскного генома GRCh38 / hg38 рекомендуют использовать версию dbNSFP 3.2 Academic размером 14.4 Gb. На момент подготовки статьи ее можно было скачать по этой ссылке, а индексный файл, по этой ссылке.

В каталоге snpEff/data создадим папку dbnsfp и сохраним там оба файла. Затем выполним команду.

В моем случае было аннотировано 7.75% данных.

Теперь мы удалим варианты низкой степени воздействия на функцию гена (LOW и MODIFIER), если только они не были аннотированы интересующими нас записями из баз данных Clinvar, GWAS, dbNSFP или dbSNP.

Все это мы сделаем при помощи команды filter:

Сформируем таблицу, в которой оставим максимум информации и которую можно будет открыть в Excel.

Перейти по этой ссылке, где нас интересуют 4 файла (clinvar.vcf.error.txt, clinvar.vcf.gz, clinvar.vcf.gz.md5, clinvar.vcf.gz.tbi), которые нужно скачать. В каталоге snpEff сохраним эти файлы по пути: data/GRCh37/clinvar/, для чего создадим соответствующие папки.

Для удобства анализа добавим текстовое описание типа варианта (SNP, вставка, делеция или смешанный), а также гетерозиготность/гомозиготность.

Содержание:

Часть 3. Обработка файлов секвенирования от А до Я
3.1. Выравнивание данных в Galaxy: от FASTQ к VCF-файлу
3.2. Что мы будем делать с файлами?
3.3. Аннотирование VCF-файла c программой snpEff

Источник